Um dos principais desafios para a produção em larga escala do etanol de segunda geração (2G) – feito a partir do bagaço da cana – é encontrar formas mais fáceis de remover da matéria-prima a lignina. Essa molécula que compõe a parede celular das plantas, conferindo resistência mecânica e proteção contra patógenos, também dificulta a obtenção da celulose. Criar variedades geneticamente modificadas, nas quais as enzimas responsáveis pela síntese de lignina encontram-se “desligadas”, tem sido uma das possibilidades estudadas. Teme-se, no entanto, que o resultado sejam plantas mais frágeis e suscetíveis a fenômenos como o embolismo (formação de bolhas de ar nas células).

Para entender como a parede celular que sofreu modificação genética se comporta, um grupo de cientistas obteve imagens tridimensionais com alta resolução de fragmentos de Arabidopsis thaliana – espécie de planta comumente usada como modelo em estudos de melhoramento – por meio de raios X (tomografia computadorizada de raios X criopticográficos). Trata-se de uma técnica de imagem que pode revelar a estrutura hierárquica tridimensional de biomateriais em grandes campos de visão. As imagens em 3D permitem esmiuçar os processos que ocorrem no interior das células e simular qual deve ser a espessura da parede celular em relação à parte interior da célula (lúmen), para que a planta não colapse.

O trabalho recebeu apoio da FAPESP por meio de um Auxílio à Pesquisa Jovens Pesquisadores e de uma Bolsa no Exterior. O artigo, assinado por uma equipe multidisciplinar, foi publicado em abril na Scientific Reports.

Os cientistas compararam porções nanométricas dos pecíolos de uma variedade selvagem de Arabidopsis thaliana e uma variedade modificada geneticamente (o mutante C4H). O pecíolo, segmento da folha que a prende ao ramo, é considerado um tecido rico em tipos celulares, o que permite a análise da maior quantidade possível de diferentes tipos de células. “O que fizemos foi olhar para diferentes tipos celulares na variedade selvagem – sabendo que alguns têm paredes mais ricas em lignina, como as fibras, por exemplo – para poder comparar com a variedade mutante. Fizemos uma estimativa da quantidade de lignina baseada na espessura da parede celular”, explica a bióloga Carla Cristina Polo, pesquisadora do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS), que integra o Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM), com sede em Campinas.

O cultivo e a preparação das amostras foram feitos no Departamento de Biologia Vegetal do Instituto de Biologia da Unicamp, em colaboração com os pesquisadores Paulo Mazzafera e Luciano Pereira. As medições foram realizadas na Suíça, na linha de luz cSAXS da Swiss Light Source (SLS) no Paul Scherrer Institute. “Nós, do LNLS, cuidamos de caracterizar essas amostras. Mas o uso de raios X e a obtenção de imagens de alta definição em 3D nos permitiram não apenas um alto nível de detalhamento das imagens maiores, como também examinar minuciosamente o interior das células. É como se pudéssemos ‘entrar’ na célula”, diz Polo.

De acordo com a pesquisadora, a aplicação de raio-X para estudo de tecidos vegetais é algo raro. “Até a publicação do nosso trabalho, não havia nada no nível de resolução ao qual chegamos. As imagens 3D nos permitem estudar processos metabólicos fundamentais das amostras ou, ainda, doenças que tenham sido descritas funcionalmente, mas não estruturalmente.”

O físico Florian Meneau, pesquisador do LNLS e líder da linha de luz Cateretê, do acelerador de partículas Sirius, reforça a importância de incentivar o desenvolvimento da metodologia. “Estamos usando raios X para fazer imagens, cujo poder de penetração nas amostras é muito maior quando comparado ao poder de penetração dos elétrons. Embora hoje a microscopia eletrônica permita chegar ao nível atômico, a imagem por raio-X ainda permite determinar a estrutura tridimensional de amostras espessas e alcançar resoluções de poucos nanômetros. Portanto, nossos experimentos são estatisticamente muito relevantes porque a quantidade de dados reforça os argumentos e conclusões dos estudos sobre o tema.”

Cuidados com a amostragem

Um dos grandes desafios, neste caso, foi garantir a integridade das amostras vegetais sob a ação dos raios X. “Quando fomos fazer a medida, buscamos tentar modificar o mínimo possível a amostra. Como a radiação geraria danos – se a planta fosse simplesmente exposta sem nenhuma preparação, haveria interação dos raios X com a matéria e suas estruturas iriam se modificar –, havia duas coisas a fazer para evitá-los: uma modificação química nas amostras ou o uso de criogenia. Nós trabalhamos com ambas”, resume Polo.

Os cientistas prepararam as amostras como se fossem fazer uma microscopia eletrônica: elas foram submetidas a um processo de desidratação, seguido de infusão em etanol e do acréscimo de agentes (para corar a parede celular, por exemplo), e posteriormente embebidas em uma resina compatível com plantas. “Isso garante que não haja água dentro da célula. Células vivas têm muita água, o que é um grande problema para a técnica de raios X. Ao retirar a água, reduzimos drasticamente o efeito do dano pela exposição e conseguimos fazer medidas mais longas e de mais alta resolução”, diz a bióloga.

Assim, o grupo fez a preparação química das amostras, mas as medições foram realizadas em temperaturas criogênicas (-180 °C). A equipe trabalhou com uma amostra de cada variedade e conseguiu medir por 18 horas. “Quando fizemos esse experimento havia pouquíssimos lugares em que era possível realizá-lo em condições criogênicas. Essa é uma das razões pelas quais a técnica é tão pouco usada para plantas. O que estamos fazendo agora é instalar aqui no Sirius [LNLS] uma linha de luz que vai nos permitir trabalhar nessas condições”, explicou Meneau.

Diferentes modalidades de experimentos visando a obtenção de imagem de alta resolução através de raios X estarão disponíveis nas linhas de luz Cateretê, Mogno, Carnaúba e Imbuia, sendo construídas na fase inicial do Sirius. A Cateretê, especificamente, está sendo otimizada para realizar imagem por difração de raios X coerente (CDI) e espectroscopia de correlação de fótons por raios X (XPCS).

Cana-de-açúcar

Polo afirma que a metodologia desenvolvida para a Arabidopsis thaliana pode ser aplicada a outras plantas, como a cana-de-açúcar, por exemplo. Inclusive o aprendizado no que diz respeito a trabalhar com fragmentos minúsculos de tecido, e não com células isoladas. “A grande dificuldade desse experimento foi trabalhar com tecidos, pois há uma série de restrições experimentais que dificultam o trabalho com fragmentos de tecido muito grandes, sejam eles de origem animal ou vegetal. Nossas amostras tinham no máximo 50 microns [μm]. Assim, focamos em selecionar ferramentas e métodos que nos permitissem extrair fragmentos de tecido muito pequenos. Aprendemos a fazer isso com a Arabidopsis e agora se pode aplicar a técnica a outros tipos de planta como, por exemplo, a cana.”

O grupo já tem um artigo preparado com foco no bagaço de cana. “Nesse caso, a metodologia é um pouco diferente, pois, em vez de olhar para a modificação genética, estamos tratando da parte química. Nos experimentos, submetemos o bagaço a tratamentos químicos ou físicos e analisamos as diferenças entre eles. Realizamos tanto análises morfológicas quanto simulações de porosidade e de fluxo, ou seja, de parâmetros que podem ser importantes para melhorar o processo de purificação ou obtenção da celulose”, conta Polo.

O artigo Correlations between lignin content and structural robustness in plants revealed by X-ray ptychography por ser lido em: www.nature.com/articles/s41598-020-63093-6.